Na de opleiding vwo studeerde Van Nieuwkerk enige tijd Nederlands aan de Universiteit van Amsterdam, maar voltooide de opleiding niet.

Van Nieuwkerk begon zijn journalistieke carrière bij Het Parool. Samen met zijn jeugdvriend Mark van den Heuvel ging hij daar in 1984 sportmensen interviewen, onder wie de schakers Kasparov en Karpov en de voetballer Johnny Rep. Later ging hij schrijvers interviewen en vernieuwde hij de literatuurpagina van de krant. In 1988 werd Matthijs van Nieuwkerk redacteur bij de kunstredactie. Uiteindelijk werd hij in 1996 hoofdredacteur. Onder zijn leiding werd besloten dat de toen nog landelijke krant zich weer volledig zou gaan richten op Amsterdam. Van Nieuwkerk werd geroemd omdat hij van het zieltogende Parool weer een vlotte eigentijdse krant wist te maken.

Zijn daaropvolgende hoofdredacteurschap van de Amsterdamse zender AT5 werd geen succes en hij maakte spoedig de overstap naar Hilversum, waar hij in 2002 netcoördinator van Nederland 3 werd. Binnen zes maanden stopte hij bij de landelijke zender, uit frustratie over de complexe omroepcultuur die de door hem gewenste veranderingen in de weg stond.

In plaats van achter de schermen ging hij nu voor de schermen werken. In de aanloop naar de Kamerverkiezingen van januari 2003 presenteerde hij samen met Felix Rottenberg (PvdA) het politieke programma Nederland Kiest. De twee mochten vervolgens ook NOVA presenteren, maar na een conflict met de redactie stopten ze er na korte tijd weer mee. In 2003 startte Van Nieuwkerk, samen met Wilfried de Jong, het programma Holland Sport, waar ze in 2005 de Zilveren Nipkowschijf mee wonnen. In 2008 stopte hij met het sportprogramma, om zich volledig te kunnen richten op De Wereld Draait Door.

In oktober 2005 begon Van Nieuwkerk met DWDD, zoals de afkorting van het VARA-programma luidt. In eerste instantie deelde hij de presentatie met Francisco van Jole en later met Claudia de Breij, die de maandagavond presenteerde omdat Van Nieuwkerk die avond Holland Sport van commentaar voorzag. In 2007 won hij met De Wereld Draait Door de Gouden Televizier-Ring en in 2011 tevens een Zilveren Nipkowschijf.

Achtereenvolgens in 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 en 2012 werd Van Nieuwkerk genomineerd voor de Zilveren Televizier-ster. Hij heeft deze echter nog nooit gewonnen.

Van Nieuwkerk is naast DWDD actief als presentator van het muzikale programma Popquiz à Go-Go en het eind december uitgezonden Top 2000 à Go-Go. In deze programma's is Leo Blokhuis zijn vaste co-presentator. Leermeesters van Van Nieuwkerk zijn Felix Rottenberg en Mart Smeets . Ook ziet Van Nieuwkerk Willem Duys als een voorbeeld.

De Wereld Draait Door is één van de best bekeken hedendaagse programma's. Er gingen geruchten over een overstap van Van Nieuwkerk naar RTL, maar dit ontkende hij met als reden dat hij van De Wereld Draait Door 'een monumentje' wil maken.

In maart 2011 presenteerde Matthijs van Nieuwkerk Je Mist Meer Dan Je Ziet, een late-night show op Nederland 3, die dan voorlopig als experiment vijf dagen achter elkaar werd uitgezonden. Vanaf 14 januari 2013 presenteert van Nieuwkerk De Wereld Leert Door, een late-night wetenschappelijk programma dat uitgezonden wordt door de VARA