審神者により宿された付喪神――刀剣男士。

和泉守兼定は、歴史を改変すべく現れる時間遡行軍からとある積荷を奪取するため、初陣の堀川国広とともに幕末の世に出陣する。

辛くも任務を成し遂げた二振りに下されたのは、新たな指令。『文久三年のとある城下町に、新たな時間遡行軍現る』と。

わずかな情報を頼りに、現れる遡行軍を迎え撃つ和泉守と堀川。しかし数で勝る遡行軍には二振りだけでは太刀打ちできず、窮地に陥ってしまう。そんな二振りの前に現れたのは、彼らの主“審神者”だった。

新たに陸奥守吉行・薬研藤四郎・蜻蛉切を加え、時間遡行軍を追って城を目指す審神者と和泉守たち。しかし城内に先行した陸奥守が目の当たりにしたのは、時間遡行軍の手に掛かり命を落とした城侍の姿だった。

地方の城への襲撃に、時間遡行軍の真意を図りかねる和泉守たちは、引き続きこの時代に留まり調査を続けることに。

審神者は和泉守兼定・陸奥守吉行・堀川国広・薬研藤四郎・蜻蛉切の五振りを第二部隊とし、和泉守を部隊長に

停泊していた蒸気船の爆発で、騒然とする港。

陸奥守は船内から生存者を助けながらも、救えなかった人々への悔しさを部隊長である和泉守にぶつける。

感情的になる陸奥守を、冷静に諭そうとする和泉守。

急造の編成で、それぞれ孤立する第二部隊の刀剣男士たち。

この時代で外国人を排斥しようとする浪士たちを時間遡行軍が利用すると考えた和泉守たちは、二手に分かれて浪士たちの動向を探ることに。

しかし浪士たちの想いを聞いてしまった陸奥守は、彼らを憂い案じるのだった。

慶応四年三月。和泉守ら第二部隊は江戸を訪れる。

彼らに下された新たな任務は、「勝海舟と西郷隆盛の会談を歴史通りに終わらせること」。

審神者は、幕末史上大きな転換点となったこの会談を阻もうと、時間遡行軍が出現するだろうと予測する。かつての主が生きた時代に思いを馳せる和泉守と堀川。

会談最終日に行動を起こす時間遡行軍。周囲を警戒する第二部隊の前に顕れたのは大太刀だった。

一方、歴史上に存在していないはずの浪士を追って軍艦へ忍び込んだ薬研は、会談が行われている屋敷への砲撃を阻むものの、多くの時間遡行軍に囲まれ窮地に陥ってしまう。

そこに顕れたのは、第二部隊の最後の刀剣男士だった。

時間遡行軍に占拠された軍艦に、時空の歪みから顕れたのは第二部隊最後の刀剣男士・鶴丸国永だった。

窮地に陥った薬研を救った鶴丸は、和泉守・陸奥守と合流し時間遡行軍の手に落ちかけていた軍艦を取り戻す。

一方、会談を守るべく屋敷周辺に残った蜻蛉切と堀川は、強敵・大太刀の力に圧倒されてしまう。さらに、海上の軍艦より行われた砲撃によって江戸の町は燃え上がり、第二部隊は追い詰められてしまうのだった。

本丸へ帰還した第二部隊。 会談を守り通すことには成功したものの、和泉守と蜻蛉切は時間遡行軍との戦いで深手を負っていた。

とくに大太刀との一騎打ちで瀕死の重傷を負った蜻蛉切は、審神者の手入れ後もなお昏睡状態が続いていた。

和泉守は時間遡行軍の企てを阻む過程で、仲間やその時代の人々や町に大きな被害が出てしまったことに、自らの指揮が正しかったのかと苦悶する。

第二部隊が本丸へと帰還する一方、永禄八年の京都へと出陣した第一部隊。

山姥切国広を隊長として編成された彼らに与えられたのは、かつてない規模で観測された時間の壁を破るノイズを調査し、時間遡行軍による歴史改変を阻止せよ、との指令だった。

時間遡行軍の狙いを探るために京の都へと向かった山姥切たちは、戦を終えているはずの町に、鬼の面をつけた辻斬りが出没しているという噂を耳にする。辻斬りが歴史改変の鍵だと考えた第一部隊は、その正体を突き止めるべく動き出す。

正体不明の辻斬りを討伐した第一部隊は本丸へ帰還せず、時間遡行軍による襲撃に巻き込まれた人々のために出来ることをしようと京に残る。

それは、任務の中で守れなかった歴史や犠牲になった人々の助けになりたいという、山姥切たちがたどり着いた想いだった。

そのころ、歴史を守ることの意味を考え続けていた和泉守は、主からの命では無く自らの意志で、第二部隊の刀剣男士へ再び共に戦ってほしいと声を掛けていく。

そして審神者から伝えられる新たな任務に、第二部隊は想いを新たに出陣する。

心新たに第二部隊が出陣したのは慶應二年の京都・伏見。

薩長同盟を成し遂げた坂本龍馬が襲撃を受ける『寺田屋事件』への介入が、時間遡行軍の狙いだと考えた第二部隊は、その目論みを阻止すべく陸奥守を中心に奔走する。

しかし、元の主との接触を避けてきた陸奥守は意図せずして坂本龍馬の窮地に出くわしてしまう。

追われる龍馬を前に、元の主への想いに葛藤する陸奥守だが…。

歴史通りに『寺田屋事件』を死守した第二部隊。

一行は伏見に留まるようにとの審神者の指令のもと、引き続き坂本龍馬を護衛することに。

それは幕末のこの地に時間遡行軍が潜伏している可能性があると観測されたためだった。

堀川は刀剣男士として課せられた使命に苦悩する一方で、元の主・土方歳三への想いを募らせていく。

堀川国広が第二部隊から姿を消した。

歴史上よりも早く薩摩藩邸から出立した坂本龍馬を追うため、第二部隊は龍馬の護衛と堀川の捜索とで二手に分かれて行動することに。

和泉守と陸奥守が向かったのは、歴史のズレと思われる火災に見舞われた薩摩藩邸。

決意の表情を宿し現れた堀川に、和泉守がとった行動は…。

去って行く堀川を追う事ができず、立ち尽くす和泉守兼定。

堀川の想いを否定することができなかった彼の前に、審神者が現れる。

審神者は和泉守が抱く心残りを取り除くため、箱館に向かうことを提案する。そこは、和泉守と堀川の元の主・土方歳三の最期の地だった。

時間遡行軍が次々と顕れる箱館の地を舞台に、和泉守は応援に呼ばれた山姥切らと共に時間遡行軍、そして、自らが残した想いに立ち向かう。

元の主・土方歳三が命を落とすことになる箱館戦争の地を訪れた和泉守兼定は、新撰組の袖章をつけた堀川国広と出会う。

それぞれの想いをぶつけ覚悟を決めた和泉守は、時間遡行軍の介入を阻止すべく陸奥守らと一本木関門を目指す。

歴史改変を目論み出現する千体の時間遡行軍に、集った第一部隊と第二部隊の刀剣男士たちは、自らに課せられた使命を抱きながら立ち向かうのだった。